除了顯微注射法外,常用的還有病毒感染、精子融合、電穿孔、基因槍等方法。
1. 顯微注射法。這是最常用且成功率較高的方法,首先需要采集動物的受精卵,然后將DNA溶液顯微鏡下注射入受精卵中。然后選注射成功的受精卵移入妊娠雌性的子宮中,待妊娠完成出生后鑒定轉基因表達情況。
2.反轉錄病毒感染法。反轉錄病毒具有侵入宿主細胞并整合于細胞染色體DNA的能力。將外源基因DNA插入反轉錄病毒載體,通過輔助細胞包裝成高感染度的病毒顆粒,感染胚胎后,將感染的桑椹期胚胎細胞導入子宮,可發(fā)育成攜帶外源基因的子代動物。該法整合率較高,目的基因不易破壞,多是單拷貝、單位點整合,適合于難以觀察到原核的禽類受精卵。由于病毒衣殼大小的限制,目的基因不宜超過10kb,否則影響活性和穩(wěn)定。此外,病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達。
3. 電脈沖法(electroporation)又稱電穿孔法,是將供體DNA與受體細胞充分混勻,在外界的高電壓短脈沖下改變細胞膜結構,使細胞膜產(chǎn)生瞬間可逆性電穿孔,從而使一定大小的DNA可以通過細胞膜進入細胞,運送到細胞核。目前在動物中電脈沖法主要用來轉化胚胎干細胞。
4. 精子導入法。利用精子作為外源基因載體,借助受精作用把外源綦因導人受精卵,整合到受精卵的基因組中,稱之為精子載體導入法,是構建轉基因動物的一種新嘗試。該法簡單、方便,依靠生理受帶過程,免去了對原核的損傷。但在實踐中成功率較低,對精子是否可作為外源DNA的載體也存在爭論。目前這_技術尚處在探索階段。該法可以將人工授精、體外受精與轉